緊張素Ⅱ 1 型受體拮抗劑對小鼠腎臟的保護作用機制。
1材料與方法
1.1實驗動物 清潔級雄性 SD 大鼠 18 只, 體重 180±20g , 在溫州醫學院實驗動物中心飼養, 人工光照, 陰暗各 12h, 自由飲食。 動物許可證號:SYXK(浙)2005-0061 。
1.2實驗藥物與試劑 纈沙坦膠囊(北京諾華制藥公司, 藥準字 H20040217);Ang Ⅱ 放elisa免試劑盒;鼠抗人 TG F-β1 、a-SM A 單克隆抗體;山羊抗鼠 IgG抗體;免疫組化檢測試劑盒、DA B顯色劑。
1.3造模與分組 模型制作:用 3 戊巴比tuo鈉按 0.15mL· kg -1 的劑量麻醉大鼠后, 行左側輸尿管結扎術。 步驟:背部肋脊角處做一縱行切口, 長約 2～ 3cm(與背部正中線平行), 夾住脂肪組織 , 取出腎臟, 將其翻向脊柱側, 以生理鹽水紗布覆
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結果
M asson 染色顯示假手術組腎臟未見明顯病變(見圖 1A , 表 1);U UO 術后第二十八天, 梗阻側腎組織腎小管間質大部分已纖維化(見圖 1B, 表 1), U U O 組與假手術組比較有非常顯著統計學意義 P <0.01 ;纈沙坦組部分近端小管上皮細胞空泡變性, 管腔內可見脫落壞死的上皮細胞, 遠端腎小管擴張。 但是纖維化程度較 U UO 組輕(見圖 1C , 表 1), 二者比較有非常顯著統計學意義 P <0.01 。免疫組化顯示假手術組大鼠腎間質只有極少量的 T GF-β1 、α-SM A 陽性表達(見圖 1D 、圖 1G , 表 1), 模型組大鼠 TG F-β1 、α-SMA 陽性表達與假手術組比較顯著增多(見圖 1E、圖 1H , 表 1)(P <0.01);纈沙坦組 TGF-β1 、α-SM A 陽性表達也較模型組明顯減少(見圖 1F 、圖 1I , 表 1)(P <0.01)。
表 1 3 組病理 M ASSON 染色以及Ang Ⅱ 、TG F-β1 和α-SM A 比較
蓋, 暴露腎蒂, 分離出輸尿管, 12 只在中 2/ 3 與下 1/ 3 處, 用 0
號線上下結扎兩次, 中間剪斷輸尿管。 提起切口處皮膚肌肉,
組別 纖維化指數
Ang Ⅱ (ng·L -1)
α-SM A
(陽性 )
TG F-β 1
(陽性 )
使腎臟回納原位, 分層縫合肌肉、皮膚層, 隨機分為模型組予以生理鹽水 1 日 1mL 灌胃;纈沙坦組為成人單位劑量的 10
倍(給藥量為 12mg/ (K g·d) ;假手術組 6 只:剖開大鼠腹腔,
分離出左側輸尿管后, 不結扎, 分層縫合, 予以生理鹽水 1 日
1mL 灌胃。 療程 1 個月。
1.4指標檢測 在 U U O 術后治療 4 周, 處死全部大鼠, 腹主動脈采血分離血漿,-80℃冰箱保存。 采用放射免疫分析法測定血漿 Ang Ⅱ 水平, 取凍存全部血漿標本, 嚴格按照上海勁馬生物科技有限公司 Ang Ⅱ 放免試劑盒說明書冰浴下檢測血漿Ang Ⅱ 水平。 所有標本均同批檢測。 取術側腎組織置于10 福爾馬林固定液中, 石蠟包埋切片, 行 M asson 染色觀察腎小管間質病變, 免疫組化染色觀察 a-SM A 及 T GF-β1 在腎間質的表達, 并應用圖像分析系統進行半定量分析。
1.5病理觀察 腎組織 M asson 染色, 光鏡觀察。 在 PAS- 9000 高清晰度數碼顯微圖像分析系統下計算腎小管間質纖維化指數。 高倍鏡(×200)下隨機選取 6 個不重疊視野測定小管間質纖維化面積與同視野小管間質總面積的百分比, 進
行半定量評分。評分標準:0 分:無病變;1 分:<25 ;2 分: 26 ～ 50 ;3 分:>50 。 每張切片取 6 個視野的平均積分, 再在各組取平均值。
1.6免疫組織化學檢測 免疫組化 T GF-β1 、a-SM A 采用 A BC 法:石 蠟切片脫蠟, 水化后, 用 0.075 胰酶于 37 ℃, 15min 或采用微波進行抗原修復, 一抗工作濃度為 1∶600 ～ 1000。 應用 DAB(二氨基聯苯胺)顯色。 常規脫水、透明、中性樹膠封片, 鏡檢, 在 400 倍光鏡下觀察、記錄免疫組化結果, 棕黃色為陽性染色。 在每張切片不包含腎小球和血管的間質區域隨機選取 20 個高倍鏡視野(X200, HPF), 用 Niko n E- clipse 80i Nis-Elements image softmare 分析系統對所選取視野中免疫組化陽性信號進行圖像分析 , 計算每個視野中陽性染色面積占總視野面積的百分比。
1.7統計方法 實驗數據以(x ±s)表示, 多組間比較采用單因素方差分析(one-w ay ANO VA), 所有統計學處理均由 SPSS 16.0 軟件完成, P <0.05 為有統計學意義。
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